- 接种细胞：将细胞消化收集至50 mL离心管中，用PBS稀释至2 x 10^6 细胞/ mL 并与基质胶 1:1 混合后，100 μL/只 接种于裸鼠右侧腰背部皮下；
- 记录：接种五天后开始记录皮下瘤体积和小鼠体重；
- 实验终点：当皮下瘤在任何一个维度直径超过15 mm后，实验终止解剖小鼠记录皮下瘤、脾脏、胸腺重量，检测皮下瘤组织增殖和干性相关基因的表达变化。
- 动物层面，构建敲低 VWA2的结肠癌细胞皮下瘤模型，记录肿瘤负荷，实验终点解剖小鼠，记录皮下瘤、脾脏、胸腺重量，检测皮下瘤组织增殖和干性相关基因的表达变化。
准备：
尺子、游标卡尺、剪刀、刀片、镊子；
马克笔、自封袋、锡箔纸、称量纸、EP管（10 ml、1.5 ml、八连管）、试管架、6/12孔板、冰盒
4 % 多聚甲醛、PBS、液氮
解剖取：皮下瘤、脾脏、胸腺 、血 #称重
皮下瘤：固定、冻存（RNA、蛋白）
- 将皮下瘤横切一片（厚度 0.5 cm），纵切一片 放于4%多聚甲醛固定；
- 靠近表皮面肿瘤取 100 mg/块 4块，放于8连管中，靠近内脏面同样取 4块，放于8连管中，冻存 （用于提RNA/蛋白）。
- 全血，4 °C 过夜， 2000 rpm 15min 4°C， 取上清于PCR管。
分离血清或血浆，根据种属不同，离心转速也有差异,推荐离心转速为:
①小鼠：一般1000-1500转/分，,4℃离心8-10分钟；
②大鼠、兔子：一般2000-2500转/分，,4℃离心8-10分钟；
③人：一般2500-3000转/分，,4℃离心8-10分钟。
- 皮下瘤伦理要求：肿瘤在小鼠体内不能超过 2000mm^3 ，即任何一个维度直径小于15mm；
- 皮下瘤体积测量：用卡尺或游标卡尺测量皮下瘤的长和宽，然后用公式 V = (L x W^2) / 2 计算皮下瘤的体积，其中 L 是长度，W 是宽度，V 是体积。
- 打开要分析的照片
- ImageJ - Plugins - IHC Profiler ，开始分析，保存结果
run("IHC Profiler", "mode=[Cytoplasmic Stained Image] vectors=[H DAB]");
- 利用bash将结果转表格
- 将从集萃药康买来的裸鼠♂（BALB/cNj-Foxn1nu/Gpt）与 相同遗传背景的 BALB/cJGpt ♀鼠交配，产生第一代杂合子（nu/+）；妊娠3周+性成熟期8周=3个月左右 ，得到成熟的杂合子子代
- 子代杂合子♀ （nu/+）与 亲代纯合裸鼠♂ （nu/nu）回交，产生（nu/+）和（nu/nu）的子代，保留纯合（nu/nu）的子代用于预实验。妊娠3周+生长4周=2个月，得到可以用于皮下瘤实验的裸鼠。
从建立到能用上，5个月的时间。
裸鼠繁殖方法最好选用纯合子隐性（nu/nu）雄鼠与杂合子（nu/+）雌鼠进行交配生产。
BALB/c小鼠性欲较旺盛，性成熟期8-10周，妊娠周期19-21天，出生体重1-2克，离乳体重7-12克，哺乳期21天，8周龄鼠20克左右。
裸鼠：目前繁殖裸鼠不用纯合雌鼠，因其繁殖性能低，一般采用杂合子交配方式或纯合雄性与杂合雌鼠交配。这种交配方法，其后代将出现表现型正常的仔鼠和裸鼠，比例为1：1。
种鼠的更替
当我们精心选择的种鼠合笼一段时间后，发现他们依旧没有怀孕生仔。我们该如何去更替繁殖笼？
-
种鼠年龄超过8个月以上或者生产6窝以上。
-
合笼配繁后连续2个月未孕或者食仔。
-
幼鼠的断奶存活数开始明显下降（如由8-10只降到2-4只）。
4.周龄合适：一般雄鼠8周龄，雌鼠6周龄可以合笼繁育。随着年龄的增长，繁殖能力在第二窝、第三窝时达到最高；随后逐渐下降，雄鼠在8月龄，雌鼠在7月龄时繁殖能力显著下降。
饲料繁殖裸鼠必须注意的问题：
⑴建立屏障系统是饲料繁殖裸鼠的重要条件。裸鼠先天性胸腺缺失，免疫系统不健全，缺乏对付外来因子的抵抗力，对病原体极易感染，在常规环境中，最多只能生存数月，因此，必须要在无病原隔离饲料环境中饲料。根据我国目前实际情况，尚不能新建更多的高标准的动物实验设施，而改造现有建筑的办法是可行的。改建后的屏障饲养室虽与科技发达国家相比是比较简陋的，但基本上达到了屏障系统设施的要求，费用大为降低，也可使裸鼠繁殖工作正常进行。
⑵裸鼠繁殖方法最好选用纯合子隐性（nu/nu）雄鼠与杂合子（nu/+）雌鼠进行交配生产。因为纯合子隐性雄鼠一般能正常生育，其仔代裸鼠和正常仔鼠的比例为1∶1；所有正常的仔鼠都是杂合子，当用这些小鼠作实验对照时，就可明显地观察到纯合子与杂合子之间的不同差异。裸鼠繁殖的其它二种方法，均存在一定缺点，如采用杂合子（nu/+）雌雄鼠交配时，其子代中裸鼠与表现型正常的仔鼠的比例为1∶3，所繁殖的裸鼠少，而且繁殖的正常小鼠可能是nu/+或+/+两种基因的小鼠，除非通过育种，否则不易区别。又如采用纯合子隐性（nu/nu）雄鼠和雌鼠交配繁殖，虽然所有的子代都是裸鼠，但这种繁育方法不很有效，因为雌裸鼠繁殖力低，同时护理也很困难。
⑶仔鼠出生后存活与否，关键在于哺乳，如不注意哺乳则哺乳期裸鼠死亡率很高。主要原因在于同窝哺乳的有杂毛纯合仔鼠发育快，体大健壮，竞争力强，与纯合裸鼠争食母乳而影响纯合裸鼠的发育，以致其消瘦死亡。为了提高裸鼠生长发育速度及存活率，采用纯合裸鼠，杂合仔鼠分别哺乳，并对雌鼠加喂高蛋白、高维生素饲料。
100 mg 组织 ：1 ml Trizol 研磨仪参数：65Hz 60秒
100 mg 组织 ：1 ml RIPA
研磨仪参数：60Hz 90秒
- 冰上操作：六孔板细胞，每孔1mlPBS，洗两次。然后用刮刀蘸取孔里部分液体刮，然后加1ml Trizol，吸到1.5ml进口EP管。（刮刀泡在酒精中，使用的时候泡在纯水中，甩干后使用。 Trizol试剂在208水池边上4℃冰箱，棕色瓶子，DEPC水也在这。）
- 冰上静置10min（再准备一套管，将离心机调至4℃。）
- 每管加入200ul氯仿，上下剧烈振摇15s，静置10min。（氯仿在试验台下面柜子，氯仿不能加入细胞板，会使细胞板溶解。）
- 离心：12000rpm，4℃，10min,然后小心吸取上层水相。（1ml Trizol吸取400ul，不要吸到白色絮状物。）
- 每管加入异丙醇400ul，上下震荡15s后，静置8min。（异丙醇在柜子下面，上面写了提RNA，使用和水相相同体积。）
- 离心：12000rpm，4℃，10min，弃上清。
- 加入1ml 75% DEPC酒精，将沉淀弹起来，离心：12000rpm，4℃，3min弃上清。
- 重复上一步，弃上清。
- 12000rpm瞬离，用20ul/10ul的枪把液体尽量吸干，开盖放置5min。
- 加DEPC水20ul，溶解混匀，移到进口PCR管。
- 208仪器打开，选择核酸，加入1ul DEPC水→确认→Blank→Measure，选择RNA-40
- 使用擦镜纸擦干液体，命名Sample，加1ul样品→Measure（测一个命名一个样品。）
- 导出数据，计算所需样品量并保存。
- 结束时清洗仪器。
反转试剂在202水池旁边冰箱
利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
- 固定：取新鲜组织，放入4%多聚甲醛 in PBS，用量为组织块体积的10-15倍;
- 石蜡切片：取材→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→展片→捞片→60℃烤片1 h以上→4℃保存。（石蜡和组织不相溶，脱水以后组织被蜡浸透）;
- 烤片：60°C烘箱烤片，至蜡透明溶解（3-4h）;
- 脱腊：二甲苯I（60°C）20 min→二甲苯II（常温）10 min;
- 复水：乙醇（100%→100%→95%→85%→75%→50%）各3 min→纯水（抗原修复前一直在水中）。（配制各浓度酒精方法：100ml 95%乙醇：95ml无水乙醇+5ml纯水，以此类推。）; 脱蜡和复水可以使后面抗体等试剂可以充分和组织中抗原等结合反应;
- 抗原修复：放至0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波炉开到高火至开始沸腾，后调至中火保持95°C以上即可，煮沸20 min，自然冷却至室温;
- 透化（膜蛋白无需）：0.3% Triton X-100 in PBS,室温孵育20 min，避光操作；
- 清洗：上下摇床， PBS，5 min；
- 封闭：甩干，画腊圈，滴加10%山羊血清 in PBST（50 μL/片），湿暗盒中室温封闭1 h；
- 一抗：将封闭液甩干，不清洗，合适浓度一抗加入10%山羊血清 in PBST（50μL/片），暗盒4°C过夜。（4℃利于抗原抗体结合稳定。）；
- 复温：37°C孵箱中孵育30-45 min（置于湿暗盒中，可适量补充抗体）；
- 清洗：PBST清洗5 min×3；
- 封闭内源性HRP：0.3% H2O2 in甲醇,室温孵育15 min（AP检测，则可不需要封闭HRP）；
- 清洗：PBST洗5 min×3；
- 二抗： 即用型试剂盒（Max Vision TM HRP-Polymer anti-Rabbit/Mouse IHC Kit）25°C，20 min；
- 清洗：PBST洗5 min×3；
- DAB显色：PBS（850 μL）+A+B+C（各一滴，约50 μL），避光1-10 min（不同抗体显色时间不同），放入蒸馏水中；
- 染核：苏木素3 min（水洗去部分颜色）→HCl-酒精10-30 s→氨水返蓝1 min→纯水洗净；
- 脱水：梯度酒精（50%→75%→85%→95%→100%→100%）各2 min→二甲苯I ，3 min→二甲苯II， 5 min；
- 封片：中性树胶(若来不及封片，可先浸泡在二甲苯中)；
溶液配制
- 0.01 mol/L pH6.0柠檬酸盐缓冲液（810 ml A+190 ml B） A.二水合柠檬酸三钠：2.941g/L，0.01 M，pH 8.0（或直接取2.382g/810ml） B.柠檬酸：2.1014g/L，0.01M，pH 2.0
- 1%氨水：1 ml浓氨水+99 ml PBS
- 1% HCl-酒精：1 ml 浓盐酸+99 ml 75%乙醇
- 固定：4%多聚甲醛对组织穿透性好，组织收缩性小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和酶，适用于免疫组化。固定时间以24 h为宜，不足可能导致边缘染色，固定过度可能会掩盖表位。
- 抗原修复方法：大部分多聚甲醛固定的组织在免疫组化染色前需要进行抗原修复步骤。固定过程中形成的亚甲基桥会将蛋白交联起来，掩盖掉抗原位点。抗原修复方法则会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原位点，使抗体能够与之结合。用于抗原修复的两种方法分别为热诱导表位修复法和酶修复法。酶修复有时会破坏切片形态，因此需要对浓度和处理时间进行测试。
- 抗体浓度：一抗和二抗的稀释倍数参考抗体说明书，不同组织需通过预实验进行梯度稀释来确定最适宜的稀释倍数。
- 封闭：二抗可能会与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应，使用产生二抗宿主来源的非免疫血清预处理该组织可最大程度减弱此反应。在一抗孵育之前使用非免疫血清进行封闭可避免 Fc 受体与一抗和二抗的结合。
- 甲醇/ H2O2 溶液：H2O2 处理可能会修饰某些抗原表位，影响这些抗原与抗体的结合。在一抗孵育步骤后，再使用H2O2 孵育组织可避免这一问题，H2O2 可使用 PBS 或水进行稀释。 对于血液涂片或其它富含过氧化物酶的组织建议使用甲醇溶液；用甲醇稀释过氧化物还有助于减少水溶液引起的对组织的损伤。其它组织使用 PBS 或水进行稀释，甲醇/ H2O2溶液孵育会导致某些抗体-抗原的结合有所下降，其中细胞表面蛋白质尤为明显。如果使用AP（碱性磷酸酶） 或荧光检测，则可不需要封闭过氧化氢酶，封闭过氧化氢酶仅适用于 HRP 偶联物。
- 透化：含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液可破坏组织的细胞膜，增加细胞通透性，允许抗体达到细胞内的目标，也可降低表面张力，使试剂轻松覆盖整个组织切片。该溶液还可溶解 Fc 受体并减少非特异性结合。
- 一抗来源：一抗宿主应与所检测的组织来源不同，如果使用小鼠组织，并且一抗也是来源于小鼠，则抗小鼠 IgG 二抗会与小鼠组织中的所有内源性 IgG 结合，并导致背景偏高。
- 背景高：组织在实验过程中应保持湿润，腊圈画的不宜过小。
- 注意事项：若脱水后切片上有大量油珠，则将玻片架从二甲苯中拿出，于通风橱中风干，再放入二甲苯中，进行封片。
run("8-bit");
run("Brightness/Contrast...");
setMinAndMax(46, 100);
call("ij.ImagePlus.setDefault16bitRange", 0);
run("Apply LUT");
run("Close");
setAutoThreshold("Default");
run("Threshold...");
setThreshold(0, 122);
run("Convert to Mask");
run("Analyze Particles...", "size=0-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Nothing display exclude summarize add in_situ");
roiManager("Show All with labels");
roiManager("Show All");
run("8-bit");
//run("Brightness/Contrast...");
setMinAndMax(0, 204);
run("Apply LUT");
setAutoThreshold("Default dark no-reset");
//setThreshold(153, 255);
setOption("BlackBackground", true);
run("Convert to Mask");
run("Analyze Particles...", "size=50-1000 exclude summarize add");
############
run("8-bit");
//run("Brightness/Contrast...");
setMinAndMax(0, 204);
//run("Threshold...");
setThreshold(143, 204, "raw");
run("Analyze Particles...", "size=50-1000 exclude summarize add");
run("8-bit");
setAutoThreshold("Default");
//run("Threshold...");
setThreshold(0, 112);
run("Convert to Mask");
run("Watershed");
run("Analyze Particles...", "size=30.18-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Nothing display exclude summarize add in_situ");
roiManager("Show All with labels");
roiManager("Show All");
run("8-bit");
makeLine(630, 479, 661, 479);
run("Set Scale...", "distance=31 known=100 pixel=1 unit=um");
run("Enhance Contrast...", "saturated=0.4 normalize");
setAutoThreshold("Default");
run("Threshold...");
setThreshold(0, 225);
run("Convert to Mask");
run("Fill Holes");
run("Watershed");
run("Analyze Particles...", "size=314-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Nothing display exclude summarize add in_situ");
roiManager("Show All with labels");
roiManager("Show All");
selectWindow("hct116_vwa2__0003_nc_32_1_48h2-1.png");
run("8-bit");
run("Enhance Contrast...", "saturated=0.50 normalize");
run("Smooth");
run("Find Edges");
doWand(200, 198, 6.0, "Legacy smooth");
run("Measure");
样品准备：细胞需要滤网过滤
- 检查仪器：废液、鞘液、WASH液、SHUT DOWN液；仪器指示灯为绿色
- 登录计算机，lixianjing；登录软件，123456lxj
- 拉下上样槽，点击start up，等待初始化；
- New Experiment 创建实验项目，设门，FSC SSC必选，
荧光通道根据实验设计选择，eGFP,
展示细胞数，点Workspace -- statistic；
- 待初始化完成，上样（吹匀样品），上样量40 ul(实际吸90 ul，50 ul死体积)，速度调到最小；
- 点击RUN 开始进样，调电压；
SSC：反应细胞颗粒度 FSC： 反映细胞大小
前向散射光（Forward scatter, FSC）和侧向散射光（side scatter, SSC）:SSC是侧向散射检测器，它测量与激光垂直的角度的散射。FSC是前向散射检测器，它测量沿着激光路径的散射。
前向散射光， FSC的值代表细胞的大小：细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。（但当检测目标为非球形细胞（如红细胞、精子等），由于细胞在液流系统中的朝向不一致，通过激光检测时容易出现同型细胞FSC差别很大，这个需要特别注意。）
侧向散射光， SSC的值代表细胞的颗粒度：细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。（SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，其强度与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。通常，一个细胞内部细胞器和颗粒越多，其SSC就越强。）
**FSC和SSC参数的用处：**1、用于区分白细胞亚群；2、用于去除粘连细胞
淋巴细胞FSC和SSC均较小，单核细胞FSC较大、SSC中等，粒细胞FSC和SSC均较大。
BL1-H 蓝色激光,YL1-H红色激光
FL2-A和FL3-A通道：PI是一种与DNA结合的荧光染料，它的激发波长为488 nm，发射波长为617 nm。
- 调补偿，Compensation ; ViewMatrix 查看补偿矩阵；
- 调试好后，速度调至100 ul/min，点击Record 记录数据，固定电压补偿参数；
- 上下一个样，直接点击Record开始进样并记录数据；
- 右键项目-Export，保存导出数据：格式-原文件、PDF、FCS；
后面有人用：
- 上 3 ml 10% 84消毒液，点击 Instrument ——Santitize；
- 上 4 ml 纯水浸没上样管，仪器指示灯为绿色；
- 填写实验记录。
后面无人使用：
- 上 3 ml 10% 84消毒液，点击 Instrument ——Shutdown，该过程40 min 左右;
- 填写实验记录。
流式配色原则：
强抗原——弱荧光，弱抗原——强荧光；
单阳、减一对照FMO
recommended dyes (染料)；Emission filter(发射过滤器)
1)细胞样品制备:细胞数量控制在1×10^5~1×10^6个。
a)贴壁细胞:小心吸除细胞培养液,用胰酶消化细胞,制备成单细胞悬液。1000 g 离心5 min,沉淀细胞,弃上清,用1 mL 预冷的PBS 润洗细胞一次,离心收集细胞。
b)悬浮细胞：1000 g 离心5 min,沉淀细胞,小心吸除上清。加入1 mL 预冷的PBS,重悬细胞,再次离心收集细胞。
c)组织细胞:将组织块用剪刀剪成尽量小的小块后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h,经过200-400 目筛网过滤得到单细胞 悬液。1000 g 离心5 min,沉淀细胞。加入约1 mL 预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
2)细胞固定：细胞沉淀用1 mL 预冷的70%乙醇轻轻混匀,4°C固定2 h 以上或者过夜。接下来1000 g,离心5 min 沉淀细 胞后,用1 mL 预冷的PBS 重悬，注意：用400目筛网过滤 。然后再次1000 g 离心5 min 沉淀细胞。
3)染色: 在0.5 mL 染色缓冲液(40301-C，该液体不宜过滤，所以要提前过滤细胞)中加入10 μL 碘化丙啶储液(40301-B)和10 μLRNase A(40301-A)溶液，混匀待用。 每个细胞样品加入0.5 mL 配置好的碘化丙啶染色液,轻度混匀重悬细胞。37°C避光孵育30 min,就可以进行流式检测,流式检测最好在5 h内完成。 【注】:配置好的PI染色液在短时间内可以4°C保存,宜当日使用。
4)流式检测和分析:用流式细胞仪进行检测，PI激发波长488 nm ，发射波长600-620 nm，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA 含量分析和光散射分析。
GFP 激发波长 488 nm，发射波长 510 nm
PI
激发波长
488 nm
，发射波长
600-620 ；
GFP
激发波长
488 nm
，发射波长
510 nm
流式检测时，已知细胞表达GFP和PI，我们选择了BL1(激发488，发射530/30)和YL1(激发561，发射585/16)
488nm 可以激发 GFP和PI ，561nm 可以激发PI
思考：实验验证488 和 561 激发PI的差异。
1、由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后 1 小时之内进行分析。
2、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。 处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞 膜的损伤，PI 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-Alexa Fluor647 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶 再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用 EDTA，EDTA 会影响 Annexin V 与 PS 的结合。
1、 样品染色
1.1、悬浮细胞：300 g，4°C离心 5 min 收集细胞。 贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后，300 g，4°C离心 5 min 收集细胞，如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
1.2、用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次均需 300g，4°C离心 5 min。
1.3、吸弃 PBS，加入 100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞。
1.4、加入 5μL Annexin V-Alexa Fluor 647 和 10 μL PI，轻轻混匀。
1.5、避光、室温反应 15 min。
1.6、加入 400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在 1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 【注】：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的 Tip 头套上小的 Tip 头吸液。
2、流式细胞仪分析
细胞用400目筛网过滤，用流式细胞仪进行检测，Alexa Fluor647 最大激发波长为 651 nm，最大发射波长为 667 nm；PI-DNA 复合物的最大激发波长为 535 nm，最大发射波 长为 615 nm。用 FlowJo软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），Alexa Fluor647 为横坐标，PI 为纵坐标。 每个样采集 10,000 events。
资料链接：如何分离隐窝并培养肠道类器官？
- 处死小鼠，泡酒精，取结肠，用预冷的PBS冲洗肠段，纵向切开肠段转移至含有15ml干净的PBS的培养皿中，用PBS洗涤肠段；
- 移至超净台，50ml 离心管中加入15 mlPBS，镊子夹住肠子一端悬于离心管上空，将肠子切成2 mm的小片段，片段落入离心管；
- 用10 ml移液管，轻轻吹打肠碎片3次，待碎片重力沉降后，吸出上清，加入15 ml PBS；
- 重复上一步，20次至上清澄清；
- 除去上清液，加入25 ml 室温的温和细胞解离试剂，离心管封口**，**在204的摇床上孵育，20 rpm，20 min；
- 细胞房，待碎片重力沉降后，吸出上清，加入10 ml 含0.1%BSA的PBS(预冷)，移液管吹打3 次，沉降；
- 取上清，用70 um滤网过滤，滤液收集至干净的50 ml离心管中，记为馏分1；
- 重复6、7步骤，5次得馏分2-6；
- 馏分 离心，290 g，4度，5min，弃上清；
- 加入10 ml 含0.1%BSA的PBS(预冷)，重悬，转移至干净的15 ml离心管，离心 290 g，4度，5min，弃上清，保留隐窝沉淀；
- 加入10 ml DMEM/F-12(预冷)，重悬；
- 吸各馏分1 ml 加入6孔板 观察，挑选合适的馏分培养；
- 细胞密度： ？/孔 ，吸取合适体积的馏分，至干净的15 ml离心管，离心200 g，4度，5 min，弃上清；
- 加 150ul IntestiCult培养基：150ul 基质胶(Matrigel) = **1：1 ，**重悬细胞；
- 24孔板，每孔 50 ul 含胶培养基，形成圆顶鼓包，放入37°培养箱加热 3 min，倒扣 4 min（使鼓包更凸）；
- 24孔板，向接种的孔补加 750 ul IntestiCult培养基(预热)，其他未接种的孔加入 1 ml 无菌PBS;
- 37° ，5% CO2 敷箱培养。
菌培养：
准备：LB培养基、LB固态培养基、SOC培养基、AMP ；
灭菌：培养基、枪头、EP管
LB固态培养基:
| LB固态培养基配方 | g/L |
|---|---|
| Trptone | 10 |
| Yest extract | 5 |
| NaCl | 10 |
| 琼脂粉 | 20 |
| AMP（降温后加） | 1 |
LB液体培养基：
| LB液体培养基配方 | g/L |
|---|---|
| Trptone | 10 |
| Yest extract | 5 |
| NaCl | 10 |
| AMP（降温后加） | 1 |
涂板（202超净台）：
- 涂板**：购买的菌液与LB液体培养基 ，**1：1000 稀释，用涂布棒涂40 ul在固体培养皿上，倒置，不封口，37 ° 培养 12-14小时；
- 小摇：LB液体培养基 6-8 ml/管 ，1个黄枪头，37° ，220 rpm，12-14h；
- 大摇：LB液体培养基 600 ml/瓶， 37° ，220 rpm，12-14h；
600ml菌液提取：
准备：50 ml离心管，10 ml EP管(灭菌)，过滤柱，注射器，滤头，RES(加RNA酶,4°保存)，LYS，NEU，EQU，WASH，ELU(50°预热)注意：LYS使用前检查有无沉淀，有30-34°水浴加热去除；50 ml离心管用84清洗，烘干,重复利用；
- 菌液分装至50ml离心管，离心 4696 g,10 min ,37 °，弃上清，加菌液，离心，弃上清，重复最终培养瓶中所有细菌被浓缩至50 ml离心管内。
- 加 8 ml RES(加酶的)，重悬吹匀沉淀；(2合一)
- 加 8 ml LYS，上下颠倒5-6次，均匀变蓝，室温孵育 ，小于等于5min，（LYS使用前检查有无沉淀，有30-34°水浴加热去除）；
- 加 8 ml NEU，上下颠倒10-15次，管中沉淀由蓝变无色即可，离心 4696 g，10min,取上清；
- 摆支架，挂过滤柱，平衡滤柱：用 12ml EQU 沿顶部的柱壁（分三次），旋转缓慢加入，防止液体在底部聚集；
- 离心后的上清，缓慢滴加至柱壁四周，此时质粒DNA富集在滤柱心上；
- 全部过滤完之后，5 ml EQU， 缓慢滴加至柱壁四周，洗脱滤柱心，弃滤柱心；
- 加8 ml WASH 至滤管 洗涤；
- 洗涤液流干后，滤管下加装10 mlEP管，加5 ml ELU 至滤管洗脱第二滤芯中的质粒，至10mlEP管内；纯化：
- 上一步的10mlEP管中加入0.7倍体积的异丙醇（3.5ml），混匀，静置2 min;
- 大号注射器拔出塞子，接上滤膜，将上一步的液体加入注射器，缓慢过滤；
- 加入2 ml 70%乙醇 洗滤膜，2-3次；
- 卸滤膜，拔塞子，装滤膜，装塞子并下压吹入空气，重复5次；
- 小号注射器加入250 ul Tris，装上一步的滤膜，用Tris洗脱下质粒DNA，滤液至1.5 mlEP管，滤液加入到小号注射器重复洗脱滤膜，3次，再吹空气，3 次，吹干；
- 核酸定量（ds-DNA)
准备：质粒、buffer（polyplus 自带的）、polyplus、
- shRNA对应的细胞系培养，铺板，12孔板，6 x 10^5 细胞/孔； 设计孔：空白、NC、shRNA 若干、poyplase
- 第二天，转染步骤：
2.1 配置： 100 ul buffer + 1ug 质粒 ，涡旋，+ 3 ul polyplase ,涡旋，室温静置 10 min;
2.2 逐滴加入12孔板中，100 ul/孔；
- 48h 后，荧光显微镜观察转染效率，EGFP绿色荧光-用蓝色激发光2，拍照，4x ,荧光，明场；
- 提RNA，检测敲低效率。
- Day 1：293T 细胞铺板，10 cm 皿 ，6~8 x 10^6 细胞；
- Day 2：计算转染所需体积：
shRNA 10 ug + PLP1 10 ug + PLP2 10 ug + VSVG **10 ug，**opti-MEM 补足至 1 ml，涡旋 20 s，
- PEI **120 ug，**涡旋 20 s，室温静置 15~20 min；
2.2 取出Day 1 铺的 293T 培养皿，将培养基更换为基础培养基 7 ml（无血清，无双抗），将上一步的混合试剂旋转滴加至培养皿中，轻轻晃匀；
2.3 放入培养箱，6~8小时后换液，换为20% FBS培养基（DMEM + 20% FBS + 1% P/S）
- Day 3：接种目标细胞与6孔板中，接种细胞密度 1 x 10^5 细胞/孔 左右；靶细胞越少，感染率越高；
- Day 4：收集 48 h 病毒。
准备：一次性注射器、0.22 um滤器、10 ml EP管；
4.1 收集含有病毒的培养基于 注射器 ，连接0.22 um滤器 ，过滤至EP 管（慢速）；
4.2 293T 细胞培养皿中加入7 ml 培养基（DMEM + 20% FBS + 1% P/S），放入培养箱；
4.3 spin infection：病毒上清EP 管中加入终浓度为8 ug/ml 的polybrene，混匀后直接加入靶细胞 3-4ml / 孔（去除原培养基），将靶细胞的6孔板包上封口膜，离心，3000 rpm，升 4 降 0，32 °C，1.5 h，离心后放入培养箱。
- Day 5：收集 72 h 病毒 。
5.1 重复 第 4 天 spin infection操作：过滤病毒上清，加入靶细胞，离心，放入培养箱；
5.2 6-8 h 后换液，换为含10 % FBS的靶细胞培养基（即McCoy's 5A + 10% FBS + 1% P/S），使靶细胞恢复生长。
时间线：
23：00 Day 2：293T培养皿 加 病毒质粒；
07：00 Day 3: 换液，20% FBS培养基 ; 接种 HT29 细胞与6孔板；
23：00 Day 4：收集48 h 病毒，转染HT29细胞；
23：00 Day 5：收集72 h 病毒，再次转染HT29细胞；
07：00 Day 6：HT29 细胞换液， 10 % FBS的HT29细胞培养基。
血球计数板：
计数室体积为1 mm×1 mm×0.1 mm=0.1 mm3=10^-4 mL；汤麦式，标识为XB-K-25，汤麦式血细胞计数板的每个计数室有25个中方格，每个中方格又分为16个小方格，即共有400个小方格，即体积为0.1 mm3的计数室被平分为400个小格。；
取计数室4个角和中央的共5个中方格进行观察计数，对于压在方格界限上的细胞应当计数相邻两边及其夹角上的细胞数，再加上中方格内的细胞数，作为该中方格的细胞总数。如果一个方格内细胞数过多，难以数清，应当再对样液进行适当稀释，一般以每个小方格内分布4~5个细胞为宜。
在细胞计数中，为较快而准确的计数，一般选择“S”型计数路径进行计数：第一排，从左向右；第二排，从右向左；第三排，从左向右；第四排，从右向左（图4）。
计算：细胞个数/mL=5个中方格中细胞总数 ÷ 5 × 25 × 稀释倍数 × 10^4 个/ml
操作步骤：
- 取10 ul 从计数池上方凹槽加入，盖上盖玻片。
- 五个区域的细胞数；
- 计算细胞个数/mL=5个中方格中细胞总数 ÷ 5 × 25 × 稀释倍数 × 10^4 个/ml
准备：成球实验专用培养皿、成球实验专用培养基
配置培养基：48.5 mL DMEM/F12 + 1% P/S + B27 1 mL + EGF 2 uL+ FGF 2 uL
EGF浓度，0.5 mg/mL ； FGF浓度，0.5 mg/mL
- 将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，5 ml 完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）终止消化，离心；
- 加入1 ml 培养基重悬成细胞悬液，并计数；
- 如果细胞密度太大，稀释 100倍，10 ul 细胞悬液 + 990 ul 培养基；稀释10倍，100 ul 细胞悬液 + 900 ul 培养基；
- 细胞接种：于6孔成球培养板中各实验组接种3000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为400-1,000个细胞/孔）;
- 观察，用ImageJ统计
一、细胞房：
- 将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；
- 细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）;
- 继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；
- 克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照；
二、细胞房外：
- 去培养液，加1 ml/孔 多聚甲醛 固定 1h；
- PBS洗三遍，加 1 ml/孔 0.5%结晶紫，常温2.5h；
- 回收结晶紫，加入1 ml PBS洗 x 8次，至染液干净孔内无残留；
- 弃去洗液，倒扣放37° 敷箱 30min。
一、细胞房内：
- 将处于对数生长期的细胞，1 ml胰酶消化后，5 ml完全培养基（基础培养基 + 10%FBS + 1%P/S）终止消化，室温1000 rpm,5 min离心，弃上清，加1 ml培养基重悬成细胞悬液，20 ul加入细胞计数板计数；
- 细胞接种：于96孔板中各实验组接种3000个细胞/孔 · 100 ul（在小皿中稀释好，量多算2ml）;
分组：培养基组、细胞组、shNC组、shRNA组；6个复孔；时间点：6，24，48，72，96 h
- 按时间点拿出细胞板固定；
二、细胞房外：
- 作用终点时，每孔加入50 ul 4 °C 预冷的TCA溶液，固定细胞；
- 静置5 min 移入4 °C冰箱，固定1 h,取出用纯水冲洗 5 遍，室温晾干；
- 染色：晾干后，每孔加入100 ul 0.4 %SRB染液（1 % 乙酸配置），30 min;
- 弃染液，用洗液（1 % 乙酸）冲洗 5 遍，室温晾干；
- 用100ul非缓冲Tris-base碱液（10mM，ph=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床振荡20 min
- 用酶标仪在575处检测吸光度值，统计
实验步骤：
将所需的材料进行灭菌，包括直尺和marker笔
1、先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2、在孔中加入约5×10^5个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。
3、第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)。
4、PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
5、放入37℃ 5% CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。
MC38 luc P0代 2022-8-26
- 取出MC38细胞的冻存管，迅速放到37°水浴锅中摇晃，使细胞解冻，解冻后的冻存管放到西边的干净传递窗；
- 培养基在37°水浴锅预热后，放到干净传递窗；
- 进入细胞间，打开生物安全柜到指定位置，等待启动3min后，用超净台内的酒精棉球擦拭台面，然后将需要的物品：枪头盒、排枪、6cm培养皿、冻存管、培养基，放入台面。
- 6cm培养皿中加入7ml培养基，然后吹匀冻存管中的细胞，并以8字轨迹将细胞加入培养皿内，前后移动混匀两次，左右移动混匀两次；
- 将细胞放入培养敷箱，从上往下第二层位置。
操作注意：
放入超净台前需喷酒精消毒，放入敷箱前需喷酒精消毒；
**无菌操作：**超净台内，无菌气流从上往下吹，禁止手、其他物品从打开的培养皿、培养基、枪头盒的上空经过；培养皿、培养基、枪头盒即开即关不要长期打开。
其他：
细胞计数：在超净台内，细胞计数板上样孔滴加20ul含有细胞的培养基
细胞冻存液配置：现用现配，10%DMSO+90%FBS血清
MC38培养基配置： DMEM+10%FBS+2mM谷氨酰胺 +0.1 mM NEAA+1 mM 丙酮酸钠+10 mM Hepes+50ug/ml 庆大霉素+1%P/S
离心：2ml离心管需要添加套管，离心设置：1000rpm或300g ，5 min
参考信息：
胰酶用量：10cm 皿加 1 ml、6 孔板加 300 ul 、12 孔板加 200 ul
- 去除培养基，加2 ml PBS洗一遍；
- 加 1 ml 胰酶，摇晃，当细胞明显脱落时，加5 ml培养基终止消化，用枪吹打壁上的细胞至全部脱落；（6cm皿操作时，胰酶适量）
- 细胞悬液移至 10mlEP管，离心 1000 rpm ,5min ，4° ；
- 取新的 10 cm培养皿，加入 8 ml 培养基；
- 加 1 ml 培养基重悬细胞，去 100 ul 细胞悬液，加入上一步的培养皿中，传代培养。 注意事项：手和袖子不能从敞开的皿/板/培养基/血清/饭盒上经过
准备：培养基、胰酶、枪头、10ml EP管、6孔板、废液缸、废液瓶
- 预热培养基和胰酶；
- 从培养箱中取出6孔板，去除培养基，加 PBS 洗两次；
- 加胰酶 -- ml/孔，1 min 左右细胞分离，加三倍体积培养基终止消化；
- 移液器轻柔吹打细胞至底部，将含有细胞的培养基转移至10mlEP管；
- 细胞计数，接种密度： -- 细胞/孔；
- 重悬细胞，8字画法 接种细胞，补加培养基；
- 上下左右晃得六孔板，各20次，使细胞均匀分布，37° ，5% CO2 敷箱培养。
- 去除培养基，加2 ml PBS洗一遍；
- 加 1 ml 胰酶，摇晃，当细胞明显脱落时，加5 ml培养基终止消化，用枪吹打壁上的细胞至全部脱落；
- 细胞悬液移至 10mlEP管，离心 1000 rpm ,5m in ，4° ；
- 准备冻存液：( 0.9 ml FPS + 0.1 ml DMSO ) / 管
- 加 1 ml冻存液重悬细胞，转移至冻存管中，标记：代数、细胞名称、操作人、时间，封口膜封口；
- 放入-80冰箱的梯度冻存盒，过夜，转移至液氮罐。